酸化還元補因子再生の操作による成長結合酵素工学

現在、バイオテクノロジーの手段を通じて再生可能原料からますます多様な化学物質が生産されています。バイオプロセスはこれらの化合物の効率的な生産のために酵素触媒に大きく依存しています。したがって、酵素が必要な環境で最適に機能することを保証することは、持続可能な生産にとって非常に重要です。

基質特異性、触媒率、(熱)安定性などの特性は、効率的な酵素駆動バイオプロセスのために最適化されるべき重要な要素の一部です。この最適化は時間がかかり、コストが高く、困難な場合もあり、したがって成長結合選択において効果的かつコスト効率の高い方法であり、望ましい特性を持つ設計酵素は非常に求められています。

酵素選択の一形態として成長結合選択を用いることの利点。酵素の活性を細胞の成長に結びつけることを含みます。この方法は高スループット選択戦略として用いることができ、成長が標的酵素による生成物合成に依存するか、酵素の活性を細胞の全体的なエネルギー状態に結びつけることで実現できます。合成生物学は成長結合選択に適した株の設計に用いられ、近年の進展は酸化還元補因子対の酸化または還元状態に欠乏した菌株の設計に焦点を当てており、これらは酵素工学のプラットフォームとして機能します。これらのプラットフォームの利用は、改良された生物触媒やバイオプロセスの開発を加速させる可能性があります。

補因子補助栄養を介した成長結合の利点

脂質、バイオ燃料、ガス、有機溶媒、ポリマー化合物など特定の化学物質の生合成に関わる酵素を選抜方法として補因子補助栄養素を利用する利点。このアプローチは、基質や生成物に関係なく目的の生成物を選択できること、酵素活性の向上を検出しやすく、酵素活性の向上を検出するための読み取り結果を提供するなど、いくつかの独自の利点があります。さらに、成長結合プラットフォームとしての補因子補助栄養素の使用は有益です。なぜなら、微生物代謝における酸化還元補因子の普及性により、工学的戦略を他の関心微生物に横方向に移転可能であり、酵素は望ましい微生物宿主の環境内で直接設計可能だからです。(図1に示されています)

図1:酵素工学における広く使われているいくつかのスクリーニング/選択技術の比較

NADH酸化に欠損する変異体

大腸菌におけるNADHの酸化は、酸素の利用可能性に応じて2つの経路で起こり得ます。好気条件下では、NADHは主に呼吸によって酸化されATPを生成し、嫌気条件下では発酵経路を通じて酸化され乳酸やエタノールが生成されます。嫌気性成長中にNADH酸化のための混合発酵経路を使えない大腸菌の変異株は、2-メチルプロパン-1-オール、2,3-ブタネジオール、1-ブタノール、L-アラニンなどの嫌気性化学物質のNADH酸化経路を駆動するために用いられています。これらの変異株は、類似の酸化還元原理を利用して酵素の設計にも用いられ、改良型が生まれています。得られた菌株は、他のNAD(P)H依存性酵素や経路の遺伝子操作に利用できます。

NAD+還元が欠損する変異体

Wenkらはジヒドロリポイル脱水素酵素(LPD)遺伝子を欠失して大腸菌株を作り出しましたが、その結果、ピルビン酸脱水素酵素活性が欠如するため、アセテート代謝から還元力(NADHおよびNADPH)を発生できなくなりました。これにより、アセテートを唯一の炭素源として好気的に育てると、出力を低下させる補助栄養性が示されました。(図2に示されています)この株は、上部解糖基質を補う場合や、NAD+依存性のホルマ、エタノール、メタノール脱水素酵素をそれぞれ基質と発現した場合にアセテート上で成長可能でした。この株は酵素工学には使用されず、酸化還元補因子の補助栄養のみが評価されました。
 

図2:中枢代謝

NADPH酸化に欠乏する変異体

大腸菌でNADP+補育性を誘導する2つの異なる戦略があり、解糖経路を工学的に操作してNADPHを過剰産生させることに依存しています。最初の戦略は、ネイティブのgapA遺伝子を欠失し、異質なNADP+依存性GAPDH酵素を発現させることを含み、第二の戦略は炭素フラックスをペントースリン酸経路を通じてリダイレクトすることです。得られる株はグルコースでは成長できませんが、最初の株は嫌気性条件下で、2つ目はグリセロールを基質とした好気条件下で成長します。これらの株は、基質特異性、触媒活性、熱安定性などの特性が改善された酵素の設計に利用されます。

NADP+還元に欠損する変異体

大腸菌、プティダ菌、グルタミクム菌の3種類の細菌は、成長のために外因性のNADPHを必要とするNADPH補助栄養性を持つよう遺伝子操作されています。大腸菌およびグルタミクム菌の場合、グルコースが炭素源として提供された場合、NADP+還元を避けるために中心代謝酵素がノックアウトされましたが、P. putidaではCRISPR/nCas9支援工学を用いて標的遺伝子のセットを順次破壊し、酸化還元代謝への関与を理解しました。その後、NADPH補助栄養株は補因子特異性に基づく成長結合酵素工学に用いられました。大腸菌を用いた単一の変異誘発は、これまでで最も効率的かつ特異的なNADP+依存性のアルマ脱水素酵素を得ました。一方、P. putidaとC. glutamicumは、この種の初期の遺伝子操作に用いられる株を示しています。

NMN+還元に欠損する変異体

NMN+減少の欠如に基づく補因子サイクルと成長を結びつける成長連合選択システムが開発されました。大腸菌のシャッフル株が用いられました。これは還元グルタチオンの産生に関与する2つの遺伝子に欠失を含んでいます。合理的変異誘発によりNMN+/NMNHサイクリングと結びつくためにNMNH依存性グルタチオン還元酵素が開発され、NMN+/NMNH補因子サイクリングと成長をサポートするためにNMN+/NMNH依存性グルコース脱水素酵素が用いられました。また、本研究では、成長結合酵素工学に初めて非標準的な酸化還元補因子補助因子を適用し、触媒効率と時間的安定性が向上した温安定性のあるリン酸脱水素酵素バリアントを生み出しました。この研究は、非標準的な酸化還元補因子の還元状態においてNMN+/NMNHのサイクリックに依存し、自己成長活性を持つ成長結合酵素工学に有用な株を提供します。

酸化還元補因子による成長結合の可能性は、特に持続可能なバイオ生産の文脈で生体触媒を設計する強力なツールとして機能しました。酸化還元補因子の合成株の生成にはかなりの進展がありましたが、この声明は、まだいくつかの未開拓の研究分野が存在することを示唆しています。その一つは、大腸菌以外の生物の補因子補育株の工学的アプローチであり、成長結合酵素工学の新たな可能性を開く可能性があります。

総じて、酸化還元共因子ベースの成長結合の利用は、特に他の高スループット酵素工学手法の要件を満たせない製品の製造において、生物触媒の工学的工学において大きな機会をもたらすことを示唆しています。持続可能な生物生産のためのより多用途で効率的な生物触媒の開発の必要性を強調し、この分野での継続的な研究の重要性を強調しています。


参考文献:Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang, a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.