酸化還元補因子再生操作による成長共役酵素工学

現在、バイオテクノロジーの手段により、再生可能な原料からますます幅広い化学物質が製造されています。バイオプロセスは、これらの化合物を効率的に生産するために酵素触媒に大きく依存しています。したがって、酵素が必要な環境で最適に機能するようにすることは、持続可能な生産にとって大きな関心事です。

基質特異性、触媒速度、(熱)安定性などの特性は、効率的な酵素駆動バイオプロセスのために最適化しなければならないいくつかの重要な要素の一つです。この最適化は、時間とコストがかかり、困難を伴う可能性があるため、効果的かつ費用対効果の高い方法では、成長共役選択に適しており、望ましい特性を持つエンジニアリング酵素が非常に求められています。

酵素選択の一形態として増殖共役選択を使用する利点、これには、酵素の活性を細胞の成長に関連付けることが含まれます。この方法は、ハイスループット選択戦略として使用でき、増殖が標的酵素による製品合成に依存するようにするか、酵素の活性を細胞の全体的なエネルギー状態に関連付けることによって達成できます。合成生物学は、成長共役選択に適した株を設計するために使用でき、最近の進歩は、酸化還元補因子ペアの酸化状態または還元状態が欠損した株の工学的株に焦点を当てており、これは酵素工学プラットフォームとして機能することができます。これらのプラットフォームの使用は、改良された生体触媒とバイオプロセスの開発を加速する可能性があります。

補因子補助栄養による成長カップリングの利点

脂質、バイオ燃料、ガス、有機溶媒、高分子化合物など、特定の化学物質の生合成に関与する酵素を工学的に選択する方法として補因子補助栄養性を使用する利点。このアプローチには、目的の基質や製品とは無関係に目的の製品を選択できること、改善された酵素活性の検出を容易にすること、改善された酵素活性を検出するための読み出しを提供することなど、いくつかのユニークな利点があります。さらに、微生物代謝における酸化還元補因子のユビキタスな性質は、工学的戦略を目的の他の微生物に横方向に伝達でき、酵素を目的の微生物宿主の環境内で直接操作できることを意味するため、補因子補助栄養体を増殖カップリングプラットフォームとして使用することは有益です。(図1参照)

図1:酵素工学で広く使用されているいくつかのスクリーニング/選択技術の比較

NADH酸化欠損変異体

大腸菌におけるNADHの酸化は、酸素の利用可能性に応じて、2つの経路で起こります。好気性条件下では、NADHは主に呼吸によって酸化されてATPを生成しますが、嫌気性条件下では、発酵経路を介して酸化されて乳酸とエタノールを生成することができます。大腸菌の変異株は、嫌気性増殖中のNADH酸化に混合発酵経路を使用できず、2-メチルプロパン-1-オール、2,3-ブタンジオール、1-ブタノール、L-アラニンなどのさまざまな化学物質の嫌気性合成のためのNADH酸化経路を駆動するために使用されてきました。これらの変異株は、同様の酸化還元原理を利用して酵素を操作するためにも使用され、その結果、改良された変異体が生じています。得られた菌株は、他のNAD(P)H依存性酵素および経路の操作に使用できます。

NAD +の減少が欠損している変異体

Wenkらは、ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ(lpd)遺伝子を欠失させることにより大腸菌株を作製したが、その結果、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性がないため、酢酸代謝による還元力(NADHおよびNADPH)を生成できなくなった。これにより、この株は、唯一の炭素源として酢酸塩上で好気的に成長させたときに、出力を低下させる補助栄養性を示しました。(図2参照)この菌株は、上部解糖基質を添加した場合、またはNAD +依存性ギ酸デヒドロゲナーゼ、エタノールデヒドロゲナーゼ、またはメタノールデヒドロゲナーゼをそれぞれの基質で発現させた場合、酢酸上で増殖することができました。この菌株は酵素工学には使用されず、酸化還元補因子補助栄養性についてのみ評価されました。
 

図2:中枢代謝

NADPH酸化欠損変異体

大腸菌にNADP+補助栄養を誘導するには、解糖系経路を操作してNADPHを過剰に産生させる方法と、2つの異なる戦略があります。第1の戦略では、天然のgapA遺伝子を欠失し、異種のNADP+依存性GAPDH酵素を発現させ、第2の戦略では、炭素フラックスをペントースリン酸経路に誘導します。得られた菌株はグルコースでは増殖できませんが、さまざまな条件で増殖を示し、最初の菌株は嫌気性条件下で増殖し、2番目の菌株はグリセロールを基質とする好気性条件下で増殖します。これらの菌株は、基質特異性、触媒活性、熱安定性などの特性を向上させた酵素のエンジニアリングに使用されます。

NADP+減少欠損変異体

大腸菌、P. putida、C. glutamicumの3種類の細菌は、NADPH補助栄養性、つまり増殖に外因性のNADPHを必要とするように操作されています。大腸菌とグルタミカム菌の場合、グルコースを炭素源として提供した場合、NADP+の減少を避けるために中枢代謝酵素がノックアウトされ、P. putidaでは、CRISPR/nCas9支援エンジニアリングを使用して標的遺伝子のセットを順次破壊し、酸化還元代謝への関与を理解しました。次に、NADPH補助栄養菌株を補因子特異性に基づく成長共役酵素工学に使用しました。大腸菌を用いた1回の突然変異誘発により、これまでで最も効率的で特異的なNADP+依存性ギ酸デヒドロゲナーゼが得られ、P. putidaとC. glutamicumは、この種のエンジニアリングに使用できる種の最初の菌株です。

NMN+還元欠損変異体

NMN+の欠乏に基づく補因子循環と成長を結びつけるために、成長結合選択システムが開発されました。還元型グルタチオンの産生に関与する2つの遺伝子の欠失を有する大腸菌SHuffle株を用いた。NMNH依存性グルタチオンレダクターゼは、このプロセスをNMN+/NMNHサイクルに結びつけるために合理的な突然変異誘発によって開発され、NMN+依存性グルコースデヒドロゲナーゼは、NMN+/NMNH補因子サイクルをサポートし、したがって増殖をサポートするために使用されました。また、この研究では、成長共役酵素工学に非標準酸化還元補因子補助栄養性を初めて適用し、in vitroで触媒効率と時間的安定性を向上させた耐熱性亜リン酸デヒドロゲナーゼ変異体が得られました。この研究は、NMN+/NMNHサイクルに依存し、非標準酸化還元補因子の還元状態を補助栄養性に依存させる、成長共役酵素工学に有用な菌株を提供する。

酸化還元補因子を介した成長カップリングの可能性は、特に持続可能なバイオ生産の文脈において、生体触媒を設計するための強力なツールとして機能しました。酸化還元補因子補助栄養性株の生成にはかなりの進歩が見られたが、この声明は、研究にはまだいくつかの未開拓の道があることを示唆している。その一つが、大腸菌以外の生物の補因子補助栄養菌株の改変であり、成長共役酵素工学の新たな可能性を切り開く可能性がある。

全体として、酸化還元補因子ベースの増殖カップリングの使用は、工学的生体触媒、特に他のハイスループット酵素工学的アプローチの要件を満たすことができない生成物の製造にとって大きな機会であることを示唆しています。また、持続可能なバイオ生産のために、より汎用性が高く効率的な生体触媒を開発する必要性を強調し、この分野での継続的な研究の重要性を強調しています。


参考文献:Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.