レドックス補因子再生の操作による成長共役型酵素工学

如今，越来越多的化学品正通过生物技术手段从可再生原料中生产。生物过程在很大程度上依赖酶催化来高效生产这些化合物。因此，确保酶在其所需环境中发挥最佳性能，对于可持续生产具有重要意义。

底物特异性、催化速率和（热）稳定性等特性，是高效酶驱动生物过程中必须优化的几个关键因素。这种优化可能耗时、昂贵且具有挑战性，因此，有效且经济的方式，例如用于生长偶联选择的酶工程方法，备受追捧。

利用生长偶联选择作为酶选择形式具有优势，该方法将酶的活性与细胞的生长联系起来。这种方法可用作高通量选择策略，可通过确保生长依赖于目标酶的产物合成，或将酶的活性与细胞的整体能量状态联系起来来实现。合成生物学可用于工程化适合生长偶联选择的菌株，近期进展集中在工程化缺乏氧化或还原态氧化还原辅因子对的菌株，这些菌株可作为酶工程平台。利用这些平台可能加速改进生物催化剂和生物过程的发展。

通过辅因子营养缺陷型进行生长偶联的益处

利用辅因子营养缺陷型作为选择方法，用于工程化参与某些化学品（如脂质、生物燃料、气体、有机溶剂或聚合物化合物）生物合成的酶。这种方法提供了几个独特的优势，包括能够独立于目标底物或产物来选择所需产物，使其更容易检测改进的酶活性，并提供检测改进酶活性的读数。此外，使用辅因子营养缺陷型作为生长偶联平台是有益的，因为氧化还原辅因子在微生物代谢中的普遍性意味着工程策略可以横向转移到其他感兴趣的微生物中，并且酶可以在所需微生物宿主的环境中直接进行工程化。（如图1所示）

图1：几种广泛使用的酶工程筛选/选择技术的比较

NADH氧化缺陷的突变体

在大肠杆菌中，NADH的氧化可通过两条途径发生，取决于氧气的可用性。在有氧条件下，NADH主要通过呼吸作用氧化以产生ATP，而在无氧条件下，它可通过发酵途径氧化产生乳酸和乙醇。无法在厌氧生长期间使用混合发酵途径氧化NADH的大肠杆菌突变菌株，已被用于驱动NADH氧化途径，用于各种化学品的厌氧合成，如2-甲基丙-1-醇、2,3-丁二醇、1-丁醇和L-丙氨酸。这些突变菌株也被用于通过利用类似的氧化还原原理来工程化酶，从而产生改进的变体。所得菌株可用于工程化其他NAD(P)H依赖性酶和途径。

NAD+还原缺陷的突变体

Wenk等人通过删除二氢硫辛酰胺脱氢酶（lpd）基因创建了一种大肠杆菌菌株，由于缺乏丙酮酸脱氢酶活性，该菌株无法从乙酸代谢中产生还原力（NADH和NADPH）。这导致该菌株在以乙酸为唯一碳源进行有氧生长时表现出对还原力的营养缺陷型。（如图2所示）该菌株在补充上部糖酵解底物或表达NAD+依赖的甲酸、乙醇或甲醇脱氢酶及其各自底物时，能够在乙酸上生长。该菌株未用于酶工程，仅评估了氧化还原辅因子营养缺陷型。
 

图2：中心代谢

NADPH氧化缺陷的突变体

有两种不同的策略可在大肠杆菌中诱导NADP+营养缺陷型，依赖于工程化糖酵解途径以过量产生NADPH。第一种策略涉及删除天然gapA基因并表达异源NADP+依赖的GAPDH酶，而第二种策略涉及将碳通量重定向通过磷酸戊糖途径。所得菌株无法在葡萄糖上生长，但在不同条件下表现出生长，第一种菌株在厌氧条件下生长，第二种菌株在有氧条件下以甘油为底物生长。这些菌株用于工程化具有改进特性（包括底物特异性、催化活性和热稳定性）的酶。

NADP+还原缺陷的突变体

三种不同的细菌，大肠杆菌、恶臭假单胞菌和谷氨酸棒杆菌，已被工程化为NADPH营养缺陷型，这意味着它们需要外源NADPH才能生长。在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌的情况下，敲除了中心代谢酶以避免在葡萄糖作为碳源时发生NADP+还原，而在恶臭假单胞菌中，使用CRISPR/nCas9辅助工程来依次破坏目标基因组，以了解它们在氧化还原代谢中的作用。然后，NADPH营养缺陷型菌株被用于基于辅因子特异性的生长偶联酶工程。使用大肠杆菌进行单轮诱变产生了迄今为止最高效和特异的NADP+依赖的甲酸脱氢酶，而恶臭假单胞菌和谷氨酸棒杆菌代表了其物种中首个可用于此类工程的菌株。

NMN+还原缺陷的突变体

NMN+の還元欠損に基づき、補因子サイクリングと増殖を結びつける増殖共役選択システムを開発した。還元型グルタチオンの産生に関与する2つの遺伝子に欠失を持つ大腸菌SHuffle株を使用した。NMNH依存性グルタチオン還元酵素を合理的変異導入により開発し、このプロセスをNMN+/NMNHサイクリングに結びつけ、NMN+依存性グルコース脱水素酵素を用いてNMN+/NMNH補因子サイクリング、ひいては増殖を支援した。また、本研究では、非標準的レドックス補因子栄養要求性を増殖共役酵素工学に初めて適用し、in vitroでの触媒効率と時間的安定性が向上した熱安定性ホスファイト脱水素酵素変異体を得た。この研究は、NMN+/NMNHサイクリングに依存し、非標準的レドックス補因子の還元状態に対して栄養要求性を示す、増殖共役酵素工学に有用な株を提供するものである。

レドックス補因子を介した増殖共役は、特に持続可能なバイオ生産の文脈において、生体触媒を工学するための強力なツールとして機能する可能性がある。レドックス補因子栄養要求性株の作製においてかなりの進歩が見られたものの、この記述は、まだ未開拓の研究の道筋がいくつか存在することを示唆している。その一つは、大腸菌以外の生物の補因子栄養要求性株を工学することであり、これにより増殖共役酵素工学の新たな可能性が開かれる可能性がある。

全体として、レドックス補因子ベースの増殖共役は、特に他のハイスループット酵素工学アプローチの要件を満たすことができない生成物の生産において、生体触媒作用を工学するための大きな機会を表すことを示唆している。持続可能なバイオ生産のための、より多用途で効率的な生体触媒の開発の必要性を強調し、この分野での継続的な研究の重要性を強調している。


参考文献：Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.