ステビアレバウジオシドDの高収率を達成するための反応条件の最適化
高糖質食は、肥満、糖尿病、心血管疾患、高血圧などの様々な慢性疾患の有病率上昇につながり、世界的な公衆衛生上の重大な懸念となっている。植物由来の天然甘味料であるステビアレバウジオシドD（レブD）は、ゼロカロリーで強い甘味と良好な味覚プロファイルを持つことから、砂糖代替品として大きな注目を集めている。
しかし、ステビア・レバウディアナ・ベルトーニにおける存在量が限られていること、また植物由来のグリコシルトランスフェラーゼの溶解性と酵素活性が低いという課題が、その広範な商業的応用を妨げてきた。これらの問題に対応するため、バチルス・サブチリス168由来の新規グリコシルトランスフェラーゼYojKが発見された。本研究では、高い溶解性と触媒効率を特徴とする遺伝子組換え細菌由来グリコシルトランスフェラーゼYojK-I241T/G327Nを紹介し、レブDの工業規模生産に大きな可能性を提供する。
YojK-I241T/G327NとAtSuSy酵素のカスケード反応を用いたレバウジオシドDの高効率生産法の開発。
植物由来グリコシルトランスフェラーゼの溶解性が低いという問題に対処するため、研究者らはバチルス・サブチリス168由来のO-グリコシルトランスフェラーゼであるYojKの利用可能性を調査した。YojKは、大きな分子を含む様々な基質に対するグリコシル化活性が実証されているため選択された。組換え発現と精製に成功した後、YojKを用いてレブAをグリコシル化し、ステビアレブDを生産した。酵素動力学解析により、YojKは他のグリコシルトランスフェラーゼと比較してレブDに対する触媒活性が低いことが明らかになった。そのため、実際の応用に向けてYojKの触媒活性を高めるための構造指向型工学の必要性が示唆された。（図1に示す）
図1
レバウジオシドDの高収率を達成するための反応条件の最適化。
pH、温度、基質濃度などの反応条件は、ステビアレブDの高収率を達成するために最適化できる。本研究では、分子動力学シミュレーションを用いて、YojK-I241T/G327N変異体がレブDのグリコシル化をどのように促進するかを調査した。この変異体は、シミュレーション中、野生型とは異なり、レブAとH14の間の安定した水素結合を維持した（図2に示す）。この安定性は、レブAのO2原子とUDPGのC1Pの間の距離にも及んだ。YojK-I241T/G327N変異体の改善された触媒効率はこれらの安定した相互作用に起因し、その実用的可能性が示唆された。
図2
しかし、中国でNMNを生産する企業は輸出事業を設立することが許可されており、NMN原料メーカーは関連する輸出基準を満たし、対応する法律条項に従うことを保証する必要があります。
結論
このアプローチにより、83.47%のレブDが得られた。注目すべきことに、1mMのUDPGを添加することで、20.59g/LのレブDを91.29%という顕著な収率で合成でき、これは従来の研究を上回った。このプロセスは、特にYojKの構造工学後において、工業規模でのレブD生産の可能性を示している。YojKは大腸菌BL21（DE3）で高い溶解性で効率的に発現できる。構造指向型工学により、二重変異体YojK-I241T/G327Nが作製され、スクロース合成酵素AtSuSyによって触媒されるUDPGのリサイクルにより、91.29%という卓越した収率でレブDの大規模生産が可能になった。本研究は、YojK-I241T/G327Nを経済的に効果的な工業規模レブD生産のための有望なツールとして提示する。
