ステビア・レバウディオサイドDの高い収率を達成するための反応条件の最適化
高糖質の食事は肥満、糖尿病、心血管疾患、高血圧など様々な慢性疾患の有病率増加を招き、世界的な公衆衛生上の重大な懸念となっています。ステビア・レバウディオサイドD(レブD)は、植物由来の天然甘味料で、カロリーゼロ、強い甘み、そして心地よい味わいから、砂糖の代替として大きな注目を集めています。
しかし、ステビア・レバウディアナ・ベルトニでの存在が限られ、植物由来グリコシルトランスフェラーゼの溶解度や酵素活性の低下という課題が、その広範な商業応用を妨げています。これらの問題に対応するため、バチルス・サブティリス168由来の新規グリコシルトランスフェラーゼ「YojK」が発見されました。本研究では、高溶解性と触媒効率を特徴とする遺伝子組み換え細菌グリコシルトランスフェラーゼYojK-I241T/G327Nを導入し、Reb Dの産業規模生産に大きな可能性を秘めています。
YojK-I241T/G327NとAtSuSy酵素のカスケード反応を用いたレバウディオサイドDの高効率産生法の開発。
植物由来のグリコシルトランスフェラーゼにおける低溶解度の問題に対処するため、研究者たちはBacillus subtilis 168由来のO-グリコシルトランスフェラーゼであるYojKを利用の可能性を調査しました。YojKは、大分子を含むさまざまな基質に対する糖鎖化活性が実証されたため選ばれました。組換えの発現と精製に成功した後、YojKはReb Aのグリコシル化に用いられ、ステビアReb Dが産生されました。酵素動態解析により、YojKは他のグリコシルトランスフェラーゼに比べてReb Dに対する触媒活性が低いことが明らかになりました。したがって、本研究はYojKの触媒活性を高めるために構造誘導型工学の必要性を示唆しています。(図1に示すように)
図1
高収率を得るための反応条件の最適化。
pH、温度、基質濃度などの反応条件は、Srevia Reb Dの高収率を得るために最適化できます。この研究では分子動力学シミュレーションを用いて、YojK-I241T/G327NバリアントがReb D糖シル化をどのように促進するかを調査しました。このバリアントは、野生型とは異なり、シミュレーション中にReb AとH14の間に安定した水素結合を維持していました(図2参照)。この安定性は、Reb AのO2原子とUDPGのC1Pの間の距離にも及びました。YojK-I241T/G327Nバリアントの触媒効率の向上はこれらの安定相互作用に起因するとされ、実用的な可能性を示唆しています。
図2
図3
結論
この方法では83.47%のReb Dが得られました。特筆すべきは、1 mM UDPGを加えることで20.59 g/L Reb Dの合成が可能で、91.29%という驚異的な収率を達成し、従来の研究を上回りました。このプロセスは、特にYojKの構造工学に続く工業規模のReb D生産の可能性を示しています。YojKは高溶解度で大腸菌BL21(DE3)で効率的に発現できます。構造誘導工学により、二重変異体YojK-I241T/G327Nが作られ、ショ糖合成酵素AtSuSy触媒のUDPGをリサイクルすることで91.29%の卓越した収率でReb Dの大規模生産が可能となりました。本研究は、YojK-I241T/G327Nを経済的に効果的な工業規模のReb D生産のための有望なツールとして提示しています。
