マウス坐骨神経におけるNAD+とその代謝物の定量
はじめに
老化および神経変性におけるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+）およびその代謝物の重要な役割は広く認識されている。老化および神経変性疾患を標的とした生化学研究および介入の進展を促進するためには、NAD+サルベージ経路におけるNAD+およびその代謝物レベルを正確に定量することが極めて重要である。本稿では、正常および損傷したマウス坐骨神経におけるNAD+およびその代謝物レベルを定量するために、堅牢かつ正確なLC-MS/MS法を適用する。NAD+およびその代謝物を定量する既存の方法の限界
NAD+およびその代謝物を定量する従来の方法（HPLC-UV、NMR、キャピラリーゾーン電気泳動、比色酵素アッセイなど）は、感度、選択性、間接測定においてさまざまな課題に直面している。細胞または組織のNAD+およびその代謝物測定のための既存のLC-MS/MSアッセイに関しても、長時間のランタイム、クロマトグラフィー保持挙動の不良、不十分なピーク形状など、克服すべき困難が依然として多く存在する。さらに、これらの方法でカバーできるのはNAD+サルベージ経路の1～3物質のみである。LC-MS/MS法の改良
既存のLC-MS/MSアッセイに基づき、クロマトグラフィー条件、代替マトリックス、MS/MS条件に関する改良が実施された。具体的には、5μMのメチレンホスホン酸を移動相添加剤として使用し、これによりシグナル強度とピーク形状が明らかに向上する。試料が比較的清浄で単純であり、サイズが小さいことを考慮し、超純水を代替マトリックスとして試験した。親水性相互作用液体クロマトグラフィーカラムおよびハイパーカーブカラムの代わりに、Waters Atlantis Premier BEH C18 AXカラムを使用した。このカラムの独自のMaxPeak HPS高性能表面技術（カラム内壁の不動態化、金属表面の除去）により、すべての分析対象物の高い再現性、ピーク対称性、ベースライン分離が可能となる。さらに、MS条件は、環状アデノシン二リン酸リボース（cADPR）チャネルにおけるNAD+干渉シグナルを最小限に抑えつつ、cADPRおよびニコチンアミドモノヌクレオチド（NMN）の応答を維持するように最適化された。イオンスプレー電圧は4000V、ターボヒーター温度は450℃、ガス1は50psi、ガス2は50psi、カーテンガスは30psi、衝突ガスは12psiである。
神経試料（正常対損傷）の代表的なクロマトグラム
5つの分析対象物すべてがベースライン分離を達成しており、cADPRは神経変性モデルにおける高感度バイオマーカーである。本稿では、坐骨神経軸索切断により軸索変性が誘発され、損傷神経ではNAD+レベルが低下しNMNレベルが上昇し、NMN/NAD+比が約2倍増加する。同時に、ニコチンアミド（NAM）およびアデノシン二リン酸リボース（ADPR）のレベルは約2倍減少し、cADPRレベルは8倍以上増加する。これらの結果は、以前に報告された研究の結果と一致しており、NAD+およびその代謝物の定量におけるこの改良されたLC-MS/MS法の正確性を検証している。
結論
この改良されたLC-MS/MS法により、NAD+、NMN、NAM、ADPR、およびcADPRの効果的なベースライン分離が5分という短いランタイム内で可能となり、さまざまな神経疾患の早期診断および老化・神経変性疾患に対する薬剤開発に貢献する。参考文献
Ma Y, Deng L, Du Z. Development and validation of an LC-MS/MS method for quantifying NAD+ and related metabolites in mice sciatic nerves and its application to a nerve injury animal model. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTAC自2012年以来，一直致力于辅酶和天然产物原料的研发、生产和销售，拥有自有工厂、170多项全球专利以及强大的研发团队。BONTAC在NADとその前駆体（例：NMNおよびNR）。選択可能なNADにはさまざまな種類があり、NAD ERグレード（エンドトキシン除去）、NADグレードI（IVD/栄養補助食品/化粧品原料粉末）、NADグレードII（API/中間体）、NADグレードIV（溶解性に高い要件がある場合）が含まれ、凍結乾燥粉末または結晶粉末の形態で提供できます。BONTAC NADの純度は98%以上に達します。
