マウス坐骨神経におけるNAD+およびその代謝物の定量化
はじめに
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)およびその代謝物の重要な成分は、加齢や神経変性において広く認識されています。老化や神経変性疾患を対象とした生化学的研究や介入の進展を促進するためには、NAD+サルベージ経路におけるNAD+およびその代謝物レベルを正確に定量化することが非常に重要です。ここでは、健全かつ正確なLC-MS/MS法を用いて、正常および損傷マウスの坐骨神経におけるNAD+およびその代謝物レベルを定量化します。NAD+およびその代謝物の定量化における既存の方法の限界
HPLC-UV、NMR、毛細管域電気泳動、比色酵素アッセイなどの従来のNAD+および代謝物の定量方法は、感度、選択性、間接測定の面で様々な課題に直面しています。既存の細胞または組織のNAD+およびその代謝物測定に関するLC-MS/MSアッセイについては、実行時間の延長、クロマトグラフィー保持の悪さ、ピーク形状の不満足など、克服すべき課題が多くあります。さらに、NAD+サルベージ経路でカバーできる物質は1〜3つに限られています。LC-MS/MS法の改良点
既存のLC-MS/MSアッセイに基づき、クロマトグラフィー条件、代替マトリックス、MS/MS条件に関する修正が行われます。具体的には、5μMのメチレンホスホニン酸が移動相添加剤として用いられ、信号強度とピーク形状を明確に促進します。ネバーサンプルは比較的清潔でシンプルで、サイズも小さいため、超純水は代替マトリックスとして試験されます。親水性相互作用型液体クロマトグラフィーカラムやハイパーカーブカラムの代わりに、Waters AtlantisのPremier BEH C18 AXカラムが使用されており、その独自のMaxPeak HPS高性能表面技術(カラム内壁のパッシベーション化、金属表面の除去)により、すべての分析対象物の高い再現性、ピーク対称性、基準分離を実現しています。さらに、MS条件は環状アデノシン二リン酸リボース(cADPR)チャネル内のNAD+干渉信号を最小限に抑えつつ、cADPRおよびニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)の応答を維持するよう最適化されており、イオンスプレー電圧は4000V、ターボヒーター温度は450°C、ガス1は50psi、ガス2は50psi、カーテンガスは30psi、衝突ガスは12psiです。
神経サンプルの代表的なクロマトグラム(正常・損傷)
5つの分析対象すべてが基線分離を達成し、cADPRは神経変性モデルにおいて感度の高いバイオマーカーとなります。ここで、坐骨神経軸索切開術は軸索変性を引き起こし、損傷神経内のNAD+レベルとNMNレベルを上昇させることで、NMN/NAD+比率が約2倍増加します。同時に、ニコチンアミド(NAM)およびアデノシンジリン酸リボース(ADPR)のレベルは約2倍に減少し、cADPRのレベルは8倍以上増加します。これらの結果は、これまで報告された研究と一致しており、この修正LS-MS/MS法がNAD+およびその代謝物の定量において正確であることを検証しています。
結論
この修正されたLC-MS/MS法は、NAD+、NMN、NAM、ADPR、CADPRを5分という短時間で効果的にベースライン分離可能にし、さまざまな神経障害の早期診断や老化・神経変性疾患の薬剤開発に寄与しています。参考文献
Ma Y, Deng L, Du Z. マウス坐骨神経におけるNAD+および関連代謝物を定量するLC-MS/MS法の開発と検証および神経損傷動物モデルへの応用。J クロマトグ A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821ボンタック・ナッド
ボンタック2012年以降、補酵素および天然製品の原材料の研究開発、製造、販売に専念しており、自社工場、170件以上の国際特許、強力な研究開発チームを有しています。BONTACは豊富な研究開発経験と、NADとその前身(例:NMNおよびNRです。選択すべきNADには様々な種類があり、NAD ERグレード(エンドキシン除去)、NADグレードI(IVD/栄養補助食品/化粧品生粉)、NADグレードII(API/中間体)、NADグレードIV(溶解度の要件が高い場合)があり、凍結乾燥粉末または結晶性粉末の形で提供されます。BONTAC NADの純度は98%を超えることがあります。
