マウス坐骨神経におけるNAD+とその代謝物の定量化
紹介
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD+)とその代謝産物が老化や神経変性に関与する重要な部分は広く認識されています。老化や神経変性疾患を対象とした生化学的研究や介入に向けた進展を促進するためには、NAD+とその代謝物レベルをNAD+サルベージ経路で正確に定量化することが非常に重要です。ここでは、頑健で正確な LC-MS/MS 分析法を適用して、正常マウスおよび損傷したマウス坐骨神経における NAD+ とその代謝物レベルを定量化します。
NAD+とその代謝物を定量するための既存の方法の限界
HPLC-UV、NMR、キャピラリーゾーン電気泳動、比色酵素アッセイなど、NAD+とその代謝物を定量する従来の方法は、感度、選択性、および間接測定においてさまざまな課題に直面しています。細胞または組織のNAD+およびその代謝物測定用の既存のLC-MS/MSアッセイについては、実行時間の延長、クロマトグラフィー保持挙動の不良、不十分なピーク形状など、克服すべき多くの問題がまだあります。さらに、NAD+サルベージ経路の1〜3物質のみがこれらの方法でカバーできます。
LC-MS/MSメソッドの改良点
既存のLC-MS/MSアッセイに基づいて、クロマトグラフィー条件、サロゲートマトリックス、およびMS/MS条件に関する変更が行われます。具体的には、移動相添加剤として5 μMのメチレンホスホン酸が使用されており、シグナル強度とピーク形状が明示的に促進されます。Neverサンプルの比較的クリーンでシンプルな性質とサイズが小さいため、超純水は代替マトリックスとしてテストされます。親水性相互作用液体クロマトグラフィーカラムやハイパーキャブレターカラムの代わりに、Waters Atlantis Premier BEH C18 AX カラムを採用し、独自の MaxPeak HPS 高性能表面テクノロジー(カラム内壁の不動態化、金属表面の除去)により、すべての分析種の高い再現性、ピーク対称性、ベースライン分離を実現します。さらに、MS条件は、cADPRおよびニコチンアミドモノヌクレオチド(NMN)の応答を維持しながら、環状アデノシン二リン酸リボース(cADPR)チャネルのNAD+干渉信号を最小限に抑えるように最適化されており、イオンスプレー電圧は4000V、ターボヒーター温度は450°C、ガス1は50psi、ガス2は50psi、カーテンガスは30psi、コリジョンガスは12psiです。
神経サンプルの代表的なクロマトグラム(正常者と負傷者)
5つの分析種すべてがベースライン分離を達成し、cADPRは神経変性モデルにおける感度の高いバイオマーカーです。ここでは、坐骨神経軸索切開術は軸索変性を誘発し、損傷した神経のNAD +レベルの低下とNMNレベルの上昇をもたらし、NMN / NAD +比が約2倍に増加します。同時に、ニコチンアミド(NAM)とアデノシン二リン酸リボース(ADPR)のレベルは約2倍に減少し、cADPRのレベルは8倍以上に増加します。これらの結果は、以前に報告された研究の結果と一致しており、NAD+とその代謝物の定量におけるこの修正LS-MS/MS法の精度を検証しています。
結論
この改良された LC-MS/MS 分析法により、NAD+、NMN、NAM、ADPR、および cADPR のベースライン分離を 5 分という短い時間で行えるようになり、さまざまな神経疾患の早期診断や老化や神経変性疾患の医薬品開発に貢献します。
参考
Ma Y、Deng L、Du Z.マウス坐骨神経におけるNAD +および関連代謝産物を定量化するためのLC-MS / MS法の開発と検証、および神経損傷動物モデルへの適用。J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821
ボンタックNAD
ボンタック 2012年以来、コエンザイムと天然製品の原材料の研究開発、製造、販売に専念しており、自己所有の工場、170を超えるグローバル特許、強力な研究開発チームを擁しています。BONTACに豊富なR &Dの経験および生合成の先端技術がののあります NADとその前駆体 (例:NMN と NR)。NAD ERグレード(エンドキシン除去)、NADグレードI(IVD/栄養補助食品/化粧品原料粉末)、NADグレードII(API/中間体)、NADグレードIV(溶解度に関するより高い要件がある場合)など、さまざまなタイプのNADを選択できます。BONTAC NADの純度は98%以上に達することがあります。
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