マウス坐骨神経におけるNAD+とその代謝産物の定量化
紹介
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド (NAD+) の重要な部分と、老化や神経変性におけるその代謝産物は広く認識されています。老化や神経変性疾患を対象とした生化学的研究や介入の進展を促進するためには、NAD+サルベージ経路におけるNAD+とその代謝産物レベルを正確に定量化することが非常に重要です。ここでは、堅牢で正確なLC-MS/MS法を適用して、正常および損傷したマウス坐骨神経におけるNAD+とその代謝産物レベルを定量します。
NAD+とその代謝産物を定量するための既存の方法の限界
HPLC-UV、NMR、キャピラリーゾーン電気泳動、比色酵素アッセイなど、NAD+とその代謝産物を定量する従来の方法は、感度、選択性、間接測定においてさまざまな課題に直面しています。細胞または組織のNAD+およびその代謝産物測定用の既存のLC-MS/MSアッセイについては、分析時間の延長、クロマトグラフィー保持挙動の悪さ、不十分なピーク形状など、克服すべき多くの困難がまだあります。さらに、これらの方法でカバーできるのは、NAD+サルベージ経路の1〜3つの物質のみです。
LC-MS/MS法の改良
既存のLC-MS/MSアッセイに基づいて、クロマトグラフィー条件、サロゲートマトリックス、およびMS/MS条件に関する変更が行われます。具体的には、5 μM のメチレンホスホン酸が移動相添加剤として使用され、シグナル強度とピーク形状が明示的に促進されます。Neverサンプルの比較的クリーンでシンプルな性質とサイズの小さいことを考えると、超純水は代替マトリックスとしてテストされます。親水性相互作用液体クロマトグラフィーカラムとハイパーカーブカラムの代わりに、Waters Atlantis Premier BEH C18 AX カラムが採用されており、独自の MaxPeak HPS 高性能表面技術(カラム内壁の不動態化、金属表面の除去)により、すべての分析種の高い再現性、ピーク対称性、ベースライン分離が可能です。また、イオンスプレー電圧は4000V、ターボヒーター温度は450°C、ガス1は50psi、ガス2は50psi、カーテンガスは30psi、コルテンガスは30psi、衝突ガスは12psi
神経サンプルの代表的なクロマトグラム(正常 vs 損傷)
5つの分析種はすべてベースライン分離を達成しており、cADPRは神経変性モデルにおける高感度バイオマーカーです。ここで、坐骨神経軸索切開術は軸索変性を誘発し、損傷した神経の NAD+ レベルの低下と NMN レベルの上昇をもたらし、その結果、NMN/NAD+ 比が約 2 倍に増加します。同時に、ニコチンアミド (NAM) とアデノシン二リン酸リボース (ADPR) のレベルは約 2 倍に減少し、cADPR レベルは 8 倍以上増加します。これらの結果は、以前に報告された研究の結果と一致しており、NAD+とその代謝産物の定量におけるこの修正LS-MS/MS法の精度を検証しています。
結論
この改良されたLC-MS/MS法により、NAD+、NMN、NAM、ADPR、CADPRを5分という短いランタイムでベースラインで効果的に分離することができ、さまざまな神経疾患の早期診断や老化や神経変性疾患の医薬品開発に貢献します。
参考
Ma Y、Deng L、Du Z. マウス坐骨神経における NAD+ および関連代謝産物を定量するための LC-MS/MS 法の開発と検証、および神経損傷動物モデルへの応用。J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821
ボンタックナッド
ボンタック2012年以来、コエンザイムおよび天然物の原材料の研究開発、製造、販売に専念しており、自社所有の工場、170を超えるグローバル特許、強力な研究開発チームを擁しています。BONTACは、生合成において豊富な研究開発経験と高度な技術を持っています。NADとその前駆体(例えば。NMNとNR)。NADには、NAD ERグレード(エンドキシン除去)、NADグレードI(IVD/栄養補助食品/化粧品原料粉末)、NADグレードII(API/中間体)、NADグレードIV(溶解度に関するより高い要件がある場合)など、さまざまな種類があり、凍結乾燥粉末または結晶性粉末の形で提供できます。BONTAC NADの純度は98%以上に達することがあります。
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